应用说明
从哺乳动物细胞中提取基因组和质粒 DNA
Maximilian Ruschig 和 Wieland Fahr，德国布伦瑞克工业大学生物技术研究所 (m.ruschig@tu-bs.de, w.fahr@tu-bs.de)
在 BioEcho 的 EchoLUTION CellCulture DNA Kit 应用中，作为复杂抗体展示项目的一部分，从培养细胞中提取了基因组 DNA 和质粒 DNA。从 1x10 6培养的人类细胞中提取了多达 40 μg 的 gDNA 。来自越来越多细胞的基因组 DNA 被成功扩增，以证明从低到高样品输入量获得的核酸组分的功能。DNA 产量在 15.000 和 2x10 6细胞之间线性增加。从转染细胞中分离的 DNA 成功转化到大肠杆菌中表明也可以使用该试剂盒分离质粒 DNA。还使用了 EchoLUTION Tissue DNA Micro Kit，从新鲜稳定的人类腺样体组织中纯化了多达 11 μg 的基因组 DNA。
介绍
虽然从细菌细胞中提取 DNA—尤其是质粒 DNA—已经得到了很好的研究，并且有许多试剂盒解决方案可用，但从哺乳动物细胞中提取 DNA 仍然是一个具有挑战性且相对昂贵的过程。为了获得最佳质量的 DNA 产品，细胞必须在数量、制备和缓冲成分方面满足某些要求。基因组和质粒 DNA 的提取对于各种不同的实验和检测来说是必要的。抗体表位作图、细胞表面展示或稳定转染细胞系的表征等应用通常需要从哺乳动物细胞中提取 DNA。在本应用简报中，我们描述了从细胞培养中培养的各种细胞系和人体组织样本中提取全基因组 DNA。我们还提取了已瞬时转染到细胞中的质粒 DNA。我们评估 DNA 质量、重现性和工作量。
实验方案
从培养细胞或组织细胞中提取基因组 DNA 后的扩增
使用 BioEcho EchoLUTION CellCulture DNA Kit 对各种哺乳动物细胞系的细胞进行 DNA 提取。根据试剂盒方案，从人类细胞系HEK293（贴壁）、Expi-293（悬浮）和JeKo（悬浮）的1x10 6 个细胞以及预分选的瞬时转染的HEK293（HEK293+）中提取DNA 。在这里，运行了 15.000 和 2.000.000 个培养细胞之间的滴定。同时，使用硅胶试剂盒从 1x10 6 HEK293 和转染的 HEK293 细胞 (HEK293+) 中提取DNA 。此外，使用 EchoLUTION Tissue gDNA Micro Kit 从新鲜或 RNAlater 稳定的人类腺样体组织各 10 μg 中提取基因组 DNA。
使用 NanoDrop 分光光度计表征提取的 DNA 的纯度和产量。使用 EchoLUTION 和 Silica 试剂盒获得的 HEK293 和 HEK293+ 提取物中相应体积的洗脱级分通过 GelRed 染色在 0.8% 琼脂糖凝胶上可视化。
随后，进行了两步嵌套 PCR，扩增基因组 AAVS-1 基因座。所得 DNA 在 1% 琼脂糖凝胶中可视化。
从哺乳动物培养细胞中提取质粒 DNA
由于使用该试剂盒从细胞中提取总 DNA，因此也应在提取的 DNA 部分中找到质粒 DNA。因此，我们用携带氨苄青霉素抗性盒 (AmpR) 的载体瞬时转染 HEK293 细胞。从 1.000.000 个细胞中提取 DNA 后，我们分别将 10、20、40 和 80 ng 提取的 DNA 转化到大肠杆菌XL1-Blue 化学感受态细菌中，在 42°C 下使用热激 45 秒，孵育细菌在 37°C、650 rpm 的 SOC 培养基中培养 30 分钟，然后将它们接种到 2xYT-GA 琼脂平板上。在 37°C 孵育过夜后，计数菌落。
结果
DNA 浓度、总产量和纯度 (A 260 / A 280 ) 如表 1 所示。使用两种制备技术（EchoLUTION 与硅胶）从未转染和瞬时转染的 HEK293 细胞中提取的 DNA 在琼脂糖凝胶中可视化（图 1）。在这两种情况下都获得了完整的高分子量 DNA，而 EchoLUTION 试剂盒的产量更高。
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在这两种情况下都获得了 DNA，而 EchoLUTION 试剂盒的产量更高。
接下来，我们想知道提取的 DNA 是否可以用于 PCR。AAVS-1 基因座可以按预期通过 2 步嵌套 PCR（每个 30 个循环）进行扩增。图 2 显示了所得的 DNA。为了在处理少量细胞时研究 DNA 质量，我们准备了从 15.000 到 2.000.000 HEK293 细胞的细胞数系列。表 2 显示了 DNA 浓度、产量和纯度。
DNA 产量在样品输入的滴定范围内线性增加（图 3）。当处理的细胞少于 125,000 个时，吸收率低于最佳值。用硅胶法提取 DNA 时也进行了类似的观察（数据未显示）。
对于表 2 中所示的实验，进行了标准的 30 循环 PCR 以查看是否仍然可以从具有减少的 A 的 DNA 中扩增基因组位点260 / 280比率。每个样品使用 25 ng 模板 DNA。结果如图 4 所示。降低的吸收率对 PCR 扩增没有影响。
从 34.000 个瞬时转染的 HEK293 细胞中提取 DNA 后，将所得 DNA 直接转化到具有化学活性的大肠杆菌XL1-Blue 细菌中。过夜培养后，总共可以回收20个克隆。DNA 测序正确证明了质粒含量。
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讨论
在测试的试剂盒中，BioEcho EchoLUTION 系列及其新颖的分离技术可从各种哺乳动物细胞制品和组织中以最快、最简单的方式提取 DNA。当在所有样品中使用相同的细胞系时，提取的 DNA 量与细胞数量相关。我们发现，即使是少量的 DNA 也可用于 PCR 类型的应用。A 260 /A 280的有效期由于稀释的 DNA 溶液的 OD 值存在局限性和差异，因此在较低 DNA 浓度下的比值有些问题 (1)。同一实验系列中更高浓度的 DNA 制备证实了这一点，其中 DNA 浓度处于可以安全测量的范围内，即使样品质量负载显着高于初始滴定点。总之，OD 测量通常应与功能研究相辅相成，以准确评估 DNA 质量 (1)。图 4 中显示的结果强调了这一点，其中 PCR 性能在样品输入量的整个滴定范围内都很稳定。所使用的试剂盒中不存在潜在的抑制性试剂可能有助于这种稳健性。
此外，使用 EchoLUTION CellCulture DNA Kit 从哺乳动物细胞中提取质粒 DNA 是可能的，无需任何额外的准备步骤。即使是少量的 DNA 也可用于将提取的 DNA 直接转化到细菌细胞中以及用于扩增反应。这可能会通过用外切核酸酶处理或其他增加质粒 DNA 与基因组 DNA 比率的方法，或通过改变转化参数（例如，使用电穿孔）来进一步增强。
参考
(1) B. 马特洛克。核酸纯度的评估。技术说明 52646，ThermoFisher Scientific。
