从哺乳动物细胞中提取基因组和质粒DNA
从哺乳动物细胞中提取基因组和质粒DNA
Maximilian Ruschig 和 Wieland Fahr，德国布伦瑞克工业大学生物技术研究所 (m.ruschig@tu-bs.de, w.fahr@tu-bs.de)
在BioEcho的EchoLUTION CellCulture DNA Kit应用中，从培养细胞中提取了基因组DNA和质粒DNA。可从1x10 6培养的人类细胞中提取了多达40 μg的gDNA 。细胞的基因组DNA被成功扩增，DNA产量在15000和 2x10 6细胞之间线性增加。从转染细胞中分离的DNA成功转化到大肠杆菌中表明也可以使用该试剂盒分离质粒 DNA。另外EchoLUTION Tissue DNA Micro Kit，从新鲜稳定的人类腺样体组织中纯化了多达11 μg的基因组DNA。
介绍
虽然从细菌细胞中提取DNA尤其是质粒DNA已经得到了很好的研究，且有许多试剂盒解决方案可用，但从哺乳动物细胞中提取DNA仍然是一个具有挑战性且相对昂贵的过程。为了获得最佳质量的DNA产品，细胞必须在数量、制备和缓冲成分方面满足某些要求。基因组和质粒DNA的提取对于各种不同的实验和检测来说是必要的。抗体表位作图、细胞表面展示或稳定转染细胞系的表征等应用通常需要从哺乳动物细胞中提取DNA。在本方案中，我们描述了从细胞培养中培养的各种细胞系和人体组织样本中提取全基因组 DNA。我们还提取了已转染到细胞中的质粒DNA。评估了DNA质量、重复性和工作量。
实验方案
从培养细胞或组织细胞中提取基因组DNA并进行扩增
使用 BioEcho EchoLUTION CellCulture DNA Kit 对各种哺乳动物细胞系的细胞进行 DNA提取。根据试剂盒方案，从人类细胞系HEK293（贴壁）、Expi-293（悬浮）和JeKo（悬浮）的1x10 6 个细胞以及预分选的瞬时转染的HEK293（HEK293+）中提取DNA 。在这里，运行了 15000 和 2000000 个培养细胞之间的滴定。同时，使用硅胶试剂盒从 1x10 6 HEK293 和转染的 HEK293 细胞 (HEK293+) 中提取DNA 。此外，使用 EchoLUTION Tissue gDNA Micro Kit 从新鲜或 RNAlater 稳定的人类腺样体组织各10 μg 中提取基因组DNA。
使用 NanoDrop 分光光度计测定提取的 DNA 的纯度和产量。使用 EchoLUTION 和 Silica 试剂盒获得的 HEK293 和 HEK293+ 提取物中相应体积的洗脱级分通过 GelRed 染色在 0.8% 琼脂糖凝胶上可视化。随后，进行了两步嵌套 PCR，扩增基因组 AAVS-1 基因组。所得DNA 在1% 琼脂糖凝胶中测定观察。
从哺乳动物培养细胞中提取质粒 DNA
由于使用该试剂盒从细胞中提取总 DNA，因此也应在提取的 DNA 部分中找到质粒 DNA。我们用携带氨苄青霉素抗性盒 (AmpR) 的载体瞬时转染 HEK293 细胞。从 1000000 个细胞中提取DNA后，我们分别将 10、20、40 和 80 ng 提取的DNA转化到大肠杆菌XL1-Blue化学感受态细菌中，使用42°C热激45秒，孵育细菌在37°C、650 rpm 的SOC培养基中培养30分钟，然后将它们接种到 2xYT-GA 琼脂平板上。在37°C孵育过夜后，计数菌落。
结果
DNA浓度、总产量和纯度 (A 260 / A 280 ) 如表 1 所示。使用两种制备技术（EchoLUTION 与硅胶）从未转染和瞬时转染的 HEK293 细胞中提取的 DNA 在琼脂糖凝胶中可视化（图 1）。在这两种情况下都获得了完整的高分子量 DNA，而 EchoLUTION 试剂盒的产量更高。
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在这两种情况下都获得了DNA，而EchoLUTION试剂盒的产量更高。
接下来，我们想知道提取的DNA是否可以用于PCR。AAVS-1 基因座可以按预期通过 2步嵌套PCR（每个 30 个循环）进行扩增。图2显示了所得的 DNA。为了在处理少量细胞时研究DNA 质量，我们准备了从15000到2000000 HEK293 细胞的细胞数系列。表 2 显示了DNA 浓度、产量和纯度。
DNA产量在样品输入的滴定范围内线性增加（图 3）。当处理的细胞少于125000个时，吸收率低于最佳值。用硅胶法提取DNA时也进行了类似的观察（数据未显示）。
对于表2中所示的实验，进行了标准的30循环PCR以查看是否仍然可以从具有减少的A的DNA中扩增基因组位点260 / 280比率。每个样品使用25 ng模板DNA。结果如图4所示。降低的吸收率对PCR扩增没有影响。
从34000个瞬时转染的HEK293细胞中提取DNA后，将所得DNA直接转化到具有化学活性的大肠杆菌XL1-Blue 细菌中。过夜培养后，总共可以回收20个克隆。DNA测序正确证明了质粒含量。
讨论
在测试的试剂盒中，BioEcho EchoLUTION 系列及其新颖的分离技术可从各种哺乳动物细胞制品和组织中以最快、最简单的方式提取DNA。当在所有样品中使用相同的细胞系时，提取的DNA量与细胞数量相关。我们发现，即使是少量的DNA也可用于PCR类型的应用。A260 /A280的有效期由于稀释DNA溶液的OD值存在局限性和差异，因此在较低DNA浓度下的比值有些问题(1)。同一实验系列中更高浓度的DNA制备证实了这一点，其中DNA 浓度处于可以安全测量的范围内，即使样品质量负载显着高于初始滴定点。总之，OD 测量通常应与功能研究相辅相成，以便准确评估 DNA 质量 (1)。图 4 中显示的结果强调了这一点，其中 PCR 性能在样品输入量的整个滴定范围内都很稳定。所使用的试剂盒中不存在潜在的抑制性试剂可能有助于这种稳健性。
此外，使用 EchoLUTION CellCulture DNA Kit 从哺乳动物细胞中提取质粒DNA是可以完成的，无需任何额外的准备步骤。即使是少量的DNA也可用于将提取的DNA直接转化到细菌细胞中以及用于扩增反应。这可能会通过用外切核酸酶处理或其他增加质粒DNA 与基因组DNA比率的方法，或通过改变转化参数（例如，使用电穿孔）来进一步增强。
